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                T4 DNA連接酶的作用原理

                更新時(shí)間:2024-02-23      點(diǎn)擊次數:912
                  T4 DNA連接酶可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA中毗鄰的5’磷酸基團和3’ 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可以修復雙鏈DNA,RNA或DNA/RNA復合體中的單鏈切口,連接DNA的粘性和平末端,但是該酶對單鏈核酸無(wú)酶活性。
                  T4 DNA連接酶的作用過(guò)程可以分為3個(gè)步驟:
                  1、連接酶的賴(lài)氨酸活性位點(diǎn)對ATP的α-磷酸基團親核攻擊,釋放PPi,并生成T4 DNA連接酶-AMP中間體。
                  2、DNA鏈的5' -磷酸基團攻擊連接酶-AMP中間體,AMP被轉移到DNA鏈的5' -磷酸基團上,生成DNA-腺苷酸中間體。
                  3、DNA鏈的3' -羥基進(jìn)攻5' -磷酸基團,形成磷酸二酯鍵,釋放AMP。
                  使用注意事項:
                  1、使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化,然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。
                  2、T4 DNA Ligase對熱敏感,容易失活。使用時(shí)請放置冰上,用后立即置冰箱中冷凍保存。
                  3、如需在接反應后滅活T4 DNA Ligase,可于65℃孵育10min即可。
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